《馬里奧與路易RPG2》的故事仍然發(fā)生在大家熟悉的蘑菇王國，只不過時間有所不同。不知為何，馬里奧與路易發(fā)現(xiàn)他們被傳送到過去，并遇到了少年時代的馬里奧與路易，4人同心協(xié)力（這也是日版取名2*2的原因）從神秘的異國力量的威脅下在一次拯救了蘑菇王國。在游戲中現(xiàn)在的馬里奧、路易與小馬里奧、小路易4人將同時登場，并利用NDS的雙屏，上屏幕顯示小馬里奧和小路易，而下屏幕顯示馬里奧與路易。游戲的整個過程中都要通過雙方的巧妙配合才可以解開一個個謎題。而新角色大恐龍 蓋西 （難道是耀西朋友？），總是處于饑餓狀態(tài)，身形巨大的它一口就能將耀西吞進肚子里。在前作中馬里奧直接使用大錘進行攻擊，而本作中由于身背小馬里奧，所以就由小馬里奧手持大錘，馬里奧攻擊時將小馬里奧聯(lián)同大錘一起對敵人進行攻擊，這使攻擊的威力比前作有所增強。同樣由于身背小馬里奧使得重量增加，所以本作中跳躍攻擊的威力也比前作大的多。另外，在放下小馬里奧后，馬里奧可以對敵人進行連續(xù)的跳躍攻擊。